在大規模並行電腦出現之前，DNA序列的讀取是逐一片段進行的。桑格定序法使用鏈終止雙脫氧核苷酸產生嵌套的DNA鏈，這些鏈在所有可能的末端位置終止。當以大小分離這些片段後，就可以推斷出鹼基的排列順序。

四個終止子分別攜帶不同的螢光染料。毛細管電泳儀可偵測片段經由雷射照射時末端鹼基的顏色，產生彩色峰層析圖。此方法對約一千個鹼基以內的讀取具有很高的準確性。

儘管新一代定序平台目前在大型專案中佔據主導地位，但桑格定序仍是驗證單一變異和對短標靶區域進行定序的黃金標準。許多臨床實驗室仍然依賴桑格測序，因為它具有可靠性高且結果易於解讀的特性。

• 經典鏈終止定序方法
• 使用螢光雙脫氧核苷酸
• 能夠產生準確且長度適中的文字。
• 仍用於驗證和目標分析