En Western blot oppdager et spesifikt protein i en prøve. Den separerer proteiner etter størrelse, overfører dem til en membran og undersøker dem med et antistoff. Resultatet er et bånd på posisjonen som tilsvarer proteinets molekylvekt. Hvis båndet er til stede, er proteinet der. Hvis det er fraværende, er ikke proteinet det. Det er et enkelt konsept, men teknikken har mange trinn og mange muligheter for feil.

Prosedyren har flere trinn. Proteiner ekstraheres fra celler eller vev og denatureres. De lastes på en polyakrylamidgel og separeres ved elektroforese. Proteinene overføres til en nitrocellulose- eller PVDF-membran. Membranen blokkeres for å forhindre uspesifikk binding. Et primært antistoff binder målproteinet. Et sekundært antistoff, koblet til et enzym eller en fluorofor, binder det primære antistoffet. Et substrat tilsettes, og signalet detekteres på film eller med et bildebehandlingssystem.

Western blots brukes til å bekrefte tilstedeværelsen av et protein, sammenligne uttrykknivåer mellom prøver og oppdage posttranslasjonelle modifikasjoner. De brukes i forskning og klinisk diagnostikk, inkludert bekreftelsestester for HIV og testen for Lyme-sykdom. De brukes også til å validere antistoffer og sjekke for off-target-effekter.

Teknikken er i beste fall semi-kvantitativ. Den krever nøye kontroller og normalisering. Den er tidkrevende og kan være kresen. Men den er fortsatt et standardverktøy innen molekylærbiologi.