Western blot detekuje specifický protein ve vzorku. Odděluje proteiny podle velikosti, přenáší je na membránu a testuje je protilátkou. Výsledkem je pás v pozici odpovídající molekulové hmotnosti proteinu. Pokud je pás přítomen, protein tam je. Pokud chybí, protein tam není. Je to jednoduchý koncept, ale technika má mnoho kroků a mnoho možností pro chyby.

Postup má několik fází. Proteiny se extrahují z buněk nebo tkání a denaturují. Jsou naneseny na polyakrylamidový gel a separovány elektroforézou. Proteiny se přenesou na nitrocelulózovou nebo PVDF membránu. Membrána je blokována, aby se zabránilo nespecifické vazbě. Primární protilátka se váže na cílový protein. Sekundární protilátka, vázaná na enzym nebo fluorofor, se váže na primární protilátku. Přidá se substrát a signál se detekuje na filmu nebo pomocí zobrazovacího systému.

Western bloty se používají k potvrzení přítomnosti proteinu, porovnání úrovní exprese mezi vzorky a detekci posttranslačních modifikací. Používají se ve výzkumu a v klinické diagnostice, včetně konfirmačního testu na HIV a testu na lymskou boreliózu. Používají se také k validaci protilátek a kontrole nežádoucích účinků.

Tato technika je v nejlepším případě semikvantitativní. Vyžaduje pečlivé kontroly a normalizaci. Je časově náročná a může být složitá. Přesto zůstává standardním nástrojem v molekulární biologii.