En Western blot detekterar ett specifikt protein i ett prov. Den separerar proteiner efter storlek, överför dem till ett membran och undersöker dem med en antikropp. Resultatet är ett band vid den position som motsvarar proteinets molekylvikt. Om bandet är närvarande finns proteinet där. Om det saknas finns proteinet inte där. Det är ett enkelt koncept, men tekniken har många steg och många möjligheter till fel.

Proceduren har flera steg. Proteiner extraheras från celler eller vävnad och denatureras. De laddas på en polyakrylamidgel och separeras genom elektrofores. Proteinerna överförs till ett nitrocellulosa- eller PVDF-membran. Membranet blockeras för att förhindra ospecifik bindning. En primär antikropp binder målproteinet. En sekundär antikropp, kopplad till ett enzym eller en fluorofor, binder den primära antikroppen. Ett substrat tillsätts och signalen detekteras på film eller med ett avbildningssystem.

Western blots används för att bekräfta närvaron av ett protein, jämföra uttrycksnivåer mellan prover och detektera posttranslationella modifieringar. De används inom forskning och klinisk diagnostik, inklusive konfirmeringstest för HIV och test för borrelia. De används också för att validera antikroppar och kontrollera effekter utanför målet.

Tekniken är i bästa fall semikvantitativ. Den kräver noggranna kontroller och normalisering. Den är tidskrävande och kan vara kräsen. Men den är fortfarande ett standardverktyg inom molekylärbiologi.