Western blot mendeteksi protein spesifik dalam sampel. Teknik ini memisahkan protein berdasarkan ukurannya, memindahkannya ke membran, dan memeriksanya dengan antibodi. Hasilnya adalah pita pada posisi yang sesuai dengan berat molekul protein. Jika pita tersebut ada, berarti protein tersebut ada. Jika tidak ada, berarti protein tersebut tidak ada. Konsepnya sederhana, tetapi teknik ini memiliki banyak langkah dan banyak peluang untuk kesalahan.

Prosedur ini memiliki beberapa tahapan. Protein diekstraksi dari sel atau jaringan dan didenaturasi. Protein tersebut dimuat ke gel poliakrilamida dan dipisahkan dengan elektroforesis. Protein dipindahkan ke membran nitroselulosa atau PVDF. Membran diblokir untuk mencegah pengikatan non-spesifik. Antibodi primer mengikat protein target. Antibodi sekunder, yang dihubungkan dengan enzim atau fluorofor, mengikat antibodi primer. Substrat ditambahkan, dan sinyal dideteksi pada film atau dengan sistem pencitraan.

Western blot digunakan untuk mengkonfirmasi keberadaan protein, membandingkan tingkat ekspresi antar sampel, dan mendeteksi modifikasi pasca-translasi. Teknik ini digunakan dalam penelitian dan diagnostik klinis, termasuk tes konfirmasi untuk HIV dan tes untuk penyakit Lyme. Western blot juga digunakan untuk memvalidasi antibodi dan memeriksa efek di luar target.

Teknik ini paling banter bersifat semi-kuantitatif. Teknik ini membutuhkan kontrol dan normalisasi yang cermat. Prosesnya memakan waktu dan bisa rumit. Namun, teknik ini tetap menjadi alat standar dalam biologi molekuler.