Kích thích không điều kiện là kích thích tự nhiên và tự động gây ra phản ứng mà không cần học hỏi trước đó. Đó là sự kiện có ý nghĩa sinh học cốt lõi trong quá trình điều kiện hóa cổ điển.

Thức ăn trong miệng là một kích thích không điều kiện gây tiết nước bọt; tiếng ồn lớn là một kích thích không điều kiện gây giật mình; một cú sốc nhẹ là một kích thích không điều kiện gây rút lui hoặc sợ hãi. Trong các thí nghiệm của Pavlov, kích thích không điều kiện là bột thịt, thứ luôn tạo ra phản ứng tiết nước bọt. Khi một kích thích trung tính được lặp đi lặp lại kết hợp với kích thích không điều kiện, kích thích trung tính sẽ trở thành một kích thích có điều kiện, có khả năng tạo ra phản ứng tương tự một cách độc lập.

Hiệu quả của một kích thích không điều kiện phụ thuộc vào cường độ của nó, trạng thái động lực của sinh vật và sự chuẩn bị tiến hóa của loài. Một số kích thích dễ dàng liên kết với các phản ứng cụ thể hơn những kích thích khác. Nếu không có kích thích không điều kiện, điều kiện hóa cổ điển không thể thiết lập một tín hiệu mới cho phản ứng đó.

Sự kiện tạo ra phản ứng đáng tin cậy ngay từ đầu chính là kích thích không điều kiện.