在分子生物學實驗室中，DNA 的切割和連接是關鍵步驟。切割由限制性內切酶完成，連接則由連接酶完成。連接酶是一種能夠將 DNA 片段連接起來的酶，它透過在一段 DNA 片段的 3' 羥基末端和另一段 DNA 片段的 5' 磷酸末端之間形成磷酸二酯鍵來實現這一功能。如果沒有連接酶，基因克隆將無法進行。

連接酶在細胞中也至關重要。 DNA連接酶在複製和修復過程中修復DNA骨架上的缺口。當複製機制複製DNA時，會產生一些必須連接起來的短片段。連接酶負責連接這些片段。當DNA受損時，修復途徑會利用連接酶來恢復DNA鏈的完整性。如果沒有連接酶，基因組就會崩潰。

在實驗室中，T4 DNA連接酶是最常用的。它源自於T4噬菌體，在室溫下即可高效發揮作用。它既能連接黏性末端（互補的單鏈突出端），也能連接平末端（沒有突出端）。黏性末端連接效率更高，因為互補的突出端會在連接酶閉合鍵之前退火。

連接酶是基因工程中的主力。它被用於克隆、文庫建構和新一代定序文庫製備。它是一種體積雖小但功能強大的酶：將基因組連接起來，使科學家能夠建立新的基因組。