細菌利用能夠切割外源DNA的酵素來抵抗病毒。這些酵素能夠辨識特定的短序列，並在該位點或附近切割DNA。它們被稱為限制性內切酶，是分子生物學的剪刀。沒有它們，基因克隆將無法實現。

限制性內切酶辨識由四到八個鹼基對組成的序列，稱為限制性位點。有些限制性內切酶直接切割兩條鏈，產生平末端。另一些則在錯位位置切割，產生帶有短單鏈突出端的黏性末端。黏性末端很有用，因為它們可以與另一DNA片段上的互補突出端退火，從而使連接酶能夠將它們連接起來。例如，EcoRI酶識別序列GAATTC，並在G和A之間切割，產生一個四鹼基的突出端。

限制性內切酶廣泛應用於多種技術。它們切割DNA用於克隆、作圖和分析；它們將DNA片段化用於測序；它們透過在突變位點或其附近切割來檢測突變；它們也用於DNA指紋圖譜分析，其中不同個體之間的DNA片段模式存在差異。

市面上可買到數百種限制性內切酶，每種酵素都有其獨特的辨識位點和切割模式。它們以其來源生物命名：EcoRI 來自大腸桿菌，HindIII 來自流感嗜血桿菌，BamHI 來自解澱粉芽孢桿菌。這種命名方式也提醒我們這些重要工具的微生物起源。