जीवाणु, विषाणुओं से अपना बचाव करने के लिए ऐसे एंजाइमों का उपयोग करते हैं जो बाहरी डीएनए को काटते हैं। ये एंजाइम विशिष्ट लघु अनुक्रमों को पहचानते हैं और डीएनए को उसी स्थान पर या उसके आस-पास काटते हैं। इन्हें प्रतिबंध एंजाइम कहा जाता है और ये आणविक जीव विज्ञान की कैंची हैं। इनके बिना जीन क्लोनिंग असंभव होगी।

प्रतिबंध एंजाइम चार से आठ बेस पेयर के अनुक्रमों को पहचानते हैं, जिन्हें प्रतिबंध स्थल कहा जाता है। कुछ एंजाइम दोनों स्ट्रैंड को सीधे काटते हैं, जिससे कुंद सिरे बनते हैं। अन्य एंजाइम अलग-अलग स्थानों पर काटते हैं, जिससे छोटे एकल-स्ट्रैंडेड ओवरहैंग वाले चिपचिपे सिरे बनते हैं। चिपचिपे सिरे उपयोगी होते हैं क्योंकि वे डीएनए के दूसरे खंड पर पूरक ओवरहैंग के साथ जुड़ सकते हैं, जिससे लाइगेज उन्हें जोड़ सकता है। उदाहरण के लिए, एंजाइम EcoRI, GAATTC अनुक्रम को पहचानता है और G और A के बीच काटता है, जिससे चार बेस का ओवरहैंग बनता है।

प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग कई तकनीकों में किया जाता है। ये क्लोनिंग, मैपिंग और विश्लेषण के लिए डीएनए को काटते हैं। ये अनुक्रमण के लिए डीएनए को खंडित करते हैं। ये किसी भिन्न स्थल पर या उसके निकट काटकर उत्परिवर्तनों का पता लगाते हैं। इनका उपयोग डीएनए फिंगरप्रिंटिंग में भी किया जाता है, जहाँ खंडों का पैटर्न व्यक्तियों के बीच भिन्न होता है।

बाजार में सैकड़ों रिस्ट्रिक्शन एंजाइम उपलब्ध हैं, जिनमें से प्रत्येक का अपना विशिष्ट पहचान स्थल और काटने का पैटर्न होता है। इनका नाम उस जीव के नाम पर रखा गया है जिससे ये उत्पन्न हुए हैं: ई. कोलाई से इकोआरआई, हीमोफिलस इन्फ्लुएंजा से हिंडआईआई, और बैसिलस एमाइलोलिक्वेफेशियंस से बैमएचआई। नामकरण की यह पद्धति इन आवश्यक उपकरणों की सूक्ष्मजीव उत्पत्ति की एक छोटी सी याद दिलाती है।