As bactérias defendem-se contra os vírus com enzimas que cortam o ADN estranho. Estas enzimas reconhecem sequências curtas específicas e cortam o ADN nesse local ou perto dele. Chamam-se enzimas de restrição e são as tesouras da biologia molecular. Sem elas, a clonagem de genes seria impossível.

As enzimas de restrição reconhecem sequências de quatro a oito pares de bases, designadas por locais de restrição. Algumas cortam diretamente através de ambas as cadeias, produzindo extremidades rombas. Outras cortam em posições deslocadas, produzindo extremidades coesivas com pequenas saliências de cadeia simples. As extremidades coesivas são úteis porque podem anular-se com saliências complementares noutro fragmento de ADN, permitindo que a ligase as una. A enzima EcoRI, por exemplo, reconhece a sequência GAATTC e corta entre G e A, produzindo uma saliência de quatro bases.

As enzimas de restrição são utilizadas em diversas técnicas. Cortam o ADN para clonagem, mapeamento e análise. Fragmentam o ADN para sequenciação. Detetam mutações cortando o ADN no local da variante ou próximo deste. São também utilizadas na tipagem de ADN, onde o padrão de fragmentos varia entre indivíduos.

Centenas de enzimas de restrição estão disponíveis comercialmente, cada uma com o seu próprio local de reconhecimento e padrão de clivagem. Recebem o nome do organismo de onde se originaram: EcoRI de *E. coli*, HindIII de *Haemophilus influenzae*, BamHI de *Bacillus amyloliquefaciens*. Esta convenção de nomenclatura serve como um pequeno lembrete das origens microbianas destas ferramentas essenciais.