Bakterier forsvarer sig mod virus med enzymer, der klipper fremmed DNA. Disse enzymer genkender specifikke korte sekvenser og klipper DNA'et på eller nær dette sted. De kaldes restriktionsenzymer, og de er molekylærbiologiens sakse. Uden dem ville genkloning være umulig.

Restriktionsenzymer genkender sekvenser på fire til otte basepar, kaldet restriktionssteder. Nogle skærer lige hen over begge strenge og producerer stumpe ender. Andre skærer i forskudte positioner og producerer klæbrige ender med korte enkeltstrengede overhæng. Klæbrige ender er nyttige, fordi de kan anneale med komplementære overhæng på et andet DNA-fragment, hvilket tillader ligase at forbinde dem. Enzymet EcoRI genkender for eksempel sekvensen GAATTC og skærer mellem G og A, hvilket producerer et overhæng på fire baser.

Restriktionsenzymer bruges i mange teknikker. De skærer DNA til kloning, kortlægning og analyse. De fragmenterer DNA til sekventering. De detekterer mutationer ved at skære på eller i nærheden af ​​et variantsted. De bruges også til DNA-fingeraftryk, hvor fragmentmønsteret varierer mellem individer.

Hundredvis af restriktionsenzymer er kommercielt tilgængelige, hver med sit eget genkendelsessted og skæremønster. De er opkaldt efter den organisme, de stammer fra: EcoRI fra E. coli, HindIII fra Haemophilus influenzae, BamHI fra Bacillus amyloliquefaciens. Navngivningskonventionen er en lille påmindelse om den mikrobielle oprindelse af disse essentielle værktøjer.