Bakterier forsvarer seg mot virus med enzymer som kutter fremmed DNA. Disse enzymene gjenkjenner spesifikke korte sekvenser og kutter DNA-et på eller nær det stedet. De kalles restriksjonsenzymer, og de er saksene innen molekylærbiologi. Uten dem ville genkloning være umulig.

Restriksjonsenzymer gjenkjenner sekvenser på fire til åtte basepar, kalt restriksjonssteder. Noen kutter rett over begge trådene og produserer butte ender. Andre kutter i forskjøvne posisjoner og produserer klebrige ender med korte enkelttrådete overheng. Klebrige ender er nyttige fordi de kan anneale med komplementære overheng på et annet DNA-fragment, slik at ligase kan bli med i dem. Enzymet EcoRI, for eksempel, gjenkjenner sekvensen GAATTC og kutter mellom G og A, og produserer et overheng på fire baser.

Restriksjonsenzymer brukes i mange teknikker. De kutter DNA for kloning, kartlegging og analyse. De fragmenterer DNA for sekvensering. De oppdager mutasjoner ved å kutte på eller i nærheten av et variantsted. De brukes også i DNA-fingeravtrykk, der mønsteret av fragmenter varierer mellom individer.

Hundrevis av restriksjonsenzymer er kommersielt tilgjengelige, hver med sitt eget gjenkjenningssted og skjæremønster. De er oppkalt etter organismen de kommer fra: EcoRI fra E. coli, HindIII fra Haemophilus influenzae, BamHI fra Bacillus amyloliquefaciens. Navnekonvensjonen er en liten påminnelse om den mikrobielle opprinnelsen til disse viktige verktøyene.