Bakteri mempertahankan diri dari virus dengan enzim yang memotong DNA asing. Enzim-enzim ini mengenali sekuens pendek spesifik dan memotong DNA di atau dekat lokasi tersebut. Enzim-enzim ini disebut enzim restriksi, dan merupakan gunting dalam biologi molekuler. Tanpa enzim-enzim ini, kloning gen tidak mungkin dilakukan.

Enzim restriksi mengenali sekuens empat hingga delapan pasangan basa, yang disebut situs restriksi. Beberapa memotong lurus melintasi kedua untai, menghasilkan ujung tumpul. Lainnya memotong pada posisi yang bergeser, menghasilkan ujung lengket dengan tonjolan untai tunggal pendek. Ujung lengket berguna karena dapat berikatan dengan tonjolan komplementer pada fragmen DNA lain, memungkinkan ligase untuk menggabungkannya. Enzim EcoRI, misalnya, mengenali sekuens GAATTC dan memotong di antara G dan A, menghasilkan tonjolan empat basa.

Enzim restriksi digunakan dalam banyak teknik. Enzim ini memotong DNA untuk kloning, pemetaan, dan analisis. Enzim ini memecah DNA untuk pengurutan. Enzim ini mendeteksi mutasi dengan memotong di atau dekat situs varian. Enzim ini juga digunakan dalam sidik jari DNA, di mana pola fragmen bervariasi antar individu.

Ratusan enzim restriksi tersedia secara komersial, masing-masing dengan situs pengenalan dan pola pemotongannya sendiri. Nama-nama enzim tersebut diambil dari organisme asalnya: EcoRI dari E. coli, HindIII dari Haemophilus influenzae, BamHI dari Bacillus amyloliquefaciens. Konvensi penamaan ini merupakan pengingat kecil tentang asal-usul mikroba dari alat-alat penting ini.