Les bactéries se défendent contre les virus grâce à des enzymes qui coupent l'ADN étranger. Ces enzymes reconnaissent de courtes séquences spécifiques et coupent l'ADN à cet endroit précis ou à proximité. On les appelle enzymes de restriction ; ce sont les ciseaux de la biologie moléculaire. Sans elles, le clonage de gènes serait impossible.

Les enzymes de restriction reconnaissent des séquences de quatre à huit paires de bases, appelées sites de restriction. Certaines coupent directement les deux brins, produisant des extrémités franches. D'autres coupent en décalé, produisant des extrémités cohésives avec de courts prolongements simple brin. Ces extrémités cohésives sont utiles car elles peuvent s'hybrider avec des prolongements complémentaires sur un autre fragment d'ADN, permettant ainsi à la ligase de les lier. L'enzyme EcoRI, par exemple, reconnaît la séquence GAATTC et coupe entre G et A, produisant un prolongement de quatre bases.

Les enzymes de restriction sont utilisées dans de nombreuses techniques. Elles coupent l'ADN pour le clonage, le séquençage et l'analyse. Elles fragmentent l'ADN pour le séquençage. Elles détectent les mutations en coupant au niveau ou à proximité d'un site variant. Elles sont également utilisées pour l'empreinte génétique, où le profil des fragments varie d'un individu à l'autre.

Des centaines d'enzymes de restriction sont disponibles dans le commerce, chacune possédant son propre site de reconnaissance et son propre motif de coupure. Elles portent le nom de l'organisme dont elles proviennent : EcoRI d'E. coli, HindIII d'Haemophilus influenzae, BamHI de Bacillus amyloliquefaciens. Cette nomenclature rappelle l'origine microbienne de ces outils essentiels.