Quando um neurónio não está a sinalizar ativamente, a sua membrana ainda mantém uma diferença de voltagem estável, normalmente de cerca de -70 mV, com o interior negativo em relação ao exterior. Este potencial de repouso é a linha de base a partir da qual se inicia toda a sinalização elétrica.

Isto resulta da distribuição desigual de iões — elevada concentração de potássio no interior e elevada concentração de sódio no exterior — e da maior permeabilidade da membrana ao potássio em repouso. A bomba de sódio-potássio gasta energia continuamente para manter os gradientes e evitar fugas. Como o potencial de repouso é próximo do potencial de equilíbrio do potássio, pequenas alterações na condutância do potássio influenciam-no fortemente.

O potencial de repouso determina a força motriz sobre os iões e a distância ao limiar. Os fatores que o alteram — alterações no potássio extracelular, na atividade da bomba ou nas condutâncias de fundo — podem aumentar ou diminuir a excitabilidade e estão implicados em condições que vão desde a paralisia periódica hipercaliémica à depressão alastrante. A medição do potencial de repouso é uma etapa fundamental em qualquer estudo intracelular da função neuronal.

Mesmo em estado de "repouso", a membrana encontra-se em equilíbrio dinâmico, mantido pelo fluxo contínuo de iões e pelo transporte activo.