تهتز الجزيئات، فتتمدد روابطها وتنحني وتلتوي بترددات محددة. عندما يصطدم ضوء الأشعة تحت الحمراء بجزيء، فإنه يُمتص إذا تطابق تردده مع تردد الاهتزاز. والنتيجة هي طيف الأشعة تحت الحمراء، وهو رسم بياني للترددات الممتصة. تمتص كل مجموعة وظيفية بترددات مميزة، مما يجعل مطيافية الأشعة تحت الحمراء أداة فعالة لتحديد المجموعات الكيميائية.

تعتمد هذه التقنية على تمرير ضوء الأشعة تحت الحمراء عبر العينة وقياس كمية الضوء الممتص عند كل طول موجي. يُظهر الطيف الناتج قممًا عند أعداد موجية محددة، عادةً ما بين 4000 و400 سم⁻¹. تشير قمة عريضة حول 3300 سم⁻¹ إلى رابطة OH أو NH. وتشير قمة حادة حول 1700 سم⁻¹ إلى رابطة C=O. وتشير قمة حول 2200 سم⁻¹ إلى رابطة C≡N أو C≡C. أما منطقة البصمة الطيفية أسفل 1500 سم⁻¹ فهي معقدة ولكنها فريدة لكل جزيء.

تُستخدم مطيافية الأشعة تحت الحمراء في الكيمياء العضوية لتحديد المجموعات الوظيفية، وفي علم الأدلة الجنائية لتحليل الأدلة، وفي مراقبة جودة الأدوية للتحقق من هوية الدواء، وفي الرصد البيئي للكشف عن الملوثات. وهي سريعة، وغير مُتلفة، وتتطلب الحد الأدنى من تحضير العينة. وتُستخدم أجهزة مطيافية الأشعة تحت الحمراء المحمولة ميدانيًا.

لا تخلو هذه التقنية من بعض القيود، فهي لا تستطيع تحديد البنية الكاملة للجزيء، ويُفضل استخدامها بالتزامن مع طرق أخرى، مثل الرنين المغناطيسي النووي وقياس الطيف الكتلي. لكنها تبقى الأفضل في تحديد المجموعات الوظيفية.